Microbiología y Diagnóstico Genético.

DIAGNOSTICO GENÉTICO

El diagnóstico genético, al igual que todo proceso de diagnóstico médico, pretende la determinación de la causa de una enfermedad pudiendo ser de origen genético o bien infeccioso (diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas). Sin embargo, a diferencia de un diagnóstico clínico convencional, el diagnóstico molecular va más allá de la anamnesis y el estudio físico del paciente analizando, además, su ADN.

Dentro del diagnóstico molecular se engloban el diagnóstico genético y el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE MUESTRAS CLÍNICAS

1.          FASE PRE-ANALÍTICA
2.      FASE ANALÍTICA 
3.         ELABORACIÓN DE UN INFORME DE RESULTADOS
4.      CONTROL DE CALIDAD

FASE PRE-ANALÍTICA

·         Solicitud de análisis

Debe contener los datos personales del paciente, número de identificación, muestra que se solicita y tipo de análisis (rutinario, anaerobios, parásitos, etc.), información relevante (viajes, profesión, etc.), si el paciente ha estado tomando antibióticos, entre otros.

• Toma de muestra
• Transporte de la muestra al laboratorio
•  Recepción y registro de la muestra en el laboratorio 
•   Rechazo de las muestras

·         Toma de muestra

Las muestras pueden ser tomadas por el propio paciente, por un ATS, por un Médico, entre otros.

ü  Transporte de la muestra al laboratorio

ü  Recepción y registro de la muestra en el laboratorio

ü  Rechazo de las muestras

Es fundamental que la demora sea mínima. Mantener la viabilidad de los microorganismos durante el transporte (Medios de transporte, refrigeración, anaerobiosis, etc.)

• Solicitud de análisis
• Toma de muestra 
•  Transporte de la muestra al laboratorio
•  Recepción y registro de la muestra en el laboratorio
•  Rechazo de las muestra
•   Métodos no basados en el cultivo de la muestra
• Diagnóstico clínico (Pruebas diagnósticas previas)

DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO

1. Observación macroscópica
2.  Observación microscópica (observación en fresco y tinciones)
3.  Pruebas químicas
4.  Pruebas genéticas e inmunológicas en muestras crudas
5.    Etapa limitante del diagnóstico microbiológico.
6.  Selección de los medios de cultivo.
7.  Aislamiento del microorganismo causante de la infección en cultivo puro

·         Pruebas rápidas:

ü  Identificación:  Pruebas bioquímicas (actividades bioquímicas y crecimiento en fuentes de carbono)

ü  Pruebas genéticas e inmunológicas (en cultivo puro)

ü  Nivel de identificación requerido

·         FASE ANALÍTICA (3): IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO

ü  Especies patógenas y no patógenas

ü  Especies indicativas de enfermedades

ü  Identificación de cepas

ü  Recidivas

ü  Estándar de calidad

ü  Cuantificación de los resultados

ü   

·         FASE ANALÍTICA (3): SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

ü  Determinación de la sensibilidad a antibióticos

ü  Pruebas para determinar la CMI

ü  Antibiograma

·         FASE POST-ANALÍTICA

ü  Elaboración de un informe de resultados de laboratorio

ü  Control de calidad de los resultados del Laboratorio

·         INFORME DE RESULTADOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

ü  Datos de identificación del paciente

ü  Tipo de muestra, hora de la toma de muestra, hora de llegada al laboratorio

ü  Análisis solicitado

ü  Médico que ordena el análisis

ü  Resultados del análisis de la muestra:

1.      Informe directo

2.      Informe provisional o presuntivo (a veces por teléfono)

3.      Informe final

4.      Bibliografía actualizada

5.      Firma del microbiólogo y del supervisor del Laboratorio

·         RESPONSABILIDAD DEL MICROBIÓLOGO CLÍNICO

•   Rapidez de los resultados
• Morbilidad y mortalidad 
• Observación de los cultivos
• Pruebas rápidas
• Servicio permanente del laboratorio de microbiología clínica
• Responsabilidad frente al médico
• Responsabilidad frente al paciente
• Responsabilidad frente a las autoridades sanitarias

El estudio detallado de la genética bacteriana, ha permitido identificar algunos de estos genes y hoy somos capaces no solo de identificar a una bacteria como patógena cuando la aislamos produciendo enfermedad, sino también cuando encontramos en ella los genes responsables de la expresión de determinantes de patogenicidad. Esto es importante cuando no alcanza con identificar a nivel de especie una cepa bacteriana aislada de una muestra biológica patológica, para afirmar que esa bacteria es el agente causal del proceso infeccioso. Este es el caso de las enfermedades diarreicas causadas por ciertas cepas de E. coli. Como sabemos, E. coli es parte de la microflora normal del aparato intestinal del hombre y por supuesto esas bacterias no actúan como patógenos en el intestino. Sin embargo, algunas cepas especiales de la misma especie, cuando colonizan el aparato gastrointestinal, a través de la ingesta de alimentos o agua contaminados, son capaces de multiplicarse y causar un proceso infeccioso que se manifiesta con diarrea.

Estas cepas productoras de diarrea, difieren en su carga genética de las pertenecientes a la flora normal en que poseen genes que codifican para factores de virulencia, por ejemplo pueden ser capaces de producir toxinas cuyo blanco de acción es el enterocito o producir determinadas proteínas de membrana externa para adherirse a la mucosa intestinal. Entonces, cuando en una enfermedad diarreica hay que establecer el diagnóstico clínico microbiológico, por ejemplo en un lactante (edad en la que E. coli es el primer agente causal de diarrea), no alcanzará con identificar fenotípicamente como E. coli a una cepa aislada en el coprocultivo, sino que habrá que determinar la presencia de ciertos determinantes de patogenicidad para afirmar que se trata de una cepa patógena. Una opción para esto es identificar la presencia de los genes que codifican para estos determinantes. Para esto se han desarrollado técnicas de hibridación por sondas, que se basan en las propiedades de complementariedad de bases del ADN.

Una sonda, es un fragmento de ADN complementario a una región de un gen que nos interesa identificar, la cual ha sido previamente marcada con algún indicador que pueda ser detectado luego de la hibridación. El marcado puede realizarse incorporando nucleótidos radioactivos o biotinilados o marcados con digoxigenina. Si en un cultivo bacteriano interesa saber si posee el gen X, cuya secuencia es conocida, podremos construir una sonda específica para dicho gen, extraer el ADN del cultivo y mezclarlo con nuestra sonda. Esto se realiza en condiciones que puedan desnaturalizar la estructura de doble cadena de ADN, para permitir que la sonda logre hibridar con su secuencia complementaria. Así, podremos evidenciar si nuestro cultivo posee o no el gen buscado, porque de estar presente encontraremos la marca correspondiente a la sonda incorporada en la estructura del ADN. Esta técnica puede usarse aplicando la sonda directamente sobre una muestra clínica, por ejemplo una sección tisular y en ese caso se denomina hibridación in situ.

 Hoy se disponen de muchas sondas específicas de ADN usadas para el diagnóstico de muchas enfermedades bacterianas. La hibridación por sondas y otros métodos para detectar un gen en particular, es útil para realizar el diagnóstico etiológico de las infecciones producidas por microorganismos cuyo cultivo es dificultoso, ya sea por crecimiento lento como en Mycobacterium sp., o por tener requerimientos especiales de cultivo y aislamiento como Chlamydias sp., Rickettsias sp. o virus. El mayor problema diagnóstico usando hibridación por sondas, es la baja sensibilidad de la técnica, dado que es necesario que en la muestra existan suficientes copias del gen bus-cado como para que la marca correspondiente a la sonda sea detectada.

 Generalmente, las técnicas de hibridación in situ con sondas no radioactivas, son capaces de detectar más de 200 copias del gen. Por esto, muchas veces la sensibilidad de la técnica no es suficiente como para descartar aquellas muestras en las que se obtienen resultados negativos. Uno de los más interesantes avances en diagnóstico clínico, ha sido el desarrollo de un método que permite amplificar el número de copias de un determinado fragmento de ADN de interés. Esta técnica, llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permite generar millones de copias exactas de un fragmento de ADN a partir de una copia original en dos o tres horas. La PCR se basa en las propiedades de replicación del ADN la cual puede reproducirse in vitro si se coloca el ADN molde en una mezcla de ADN polimerasa, nucleótidos y cebadores específicos (primers) para las regiones del fragmento que se desea amplificar. Esta mezcla, se coloca en condiciones de pH y osmolaridad tales que permitan el funcionamiento adecuado de la polimerasa. Primero se coloca la mezcla a altas temperaturas (94 o 95ºC) para lograr que el ADN se desnaturalice, es decir que se separen ambas hebras. Luego se somete a temperaturas adecuadas para que los cebadores hibriden con el ADN molde (entre 40 y 55ºC, según la secuencia de los cebadores). En una tercera etapa, se coloca a la temperatura adecuada para que la polimerasa de ADN actúe catalizando la replicación.

Las polimerasas que se usan para estos fines, deben ser capaces de tolerar las altas temperaturas de desnaturalización del ADN, por lo que la enzima utilizada proviene de una bacteria termófila. La polimerasa más usada en PCR, proviene de Thermus aquaticus (Taq polimerasa) cuya temperatura óptima es 72ºC. Hoy se usa ésta y también otras enzimas, producidas en forma recombinante en E. coli. Estos cambios de temperatura se realizan en un termociclador, que es capaz de variar entre rangos muy amplios de temperatura en tiempos muy cortos. Este ciclado de temperaturas, por ejemplo: 94ºC por un minuto, 45ºC por un minuto y 72ºC por un minuto y medio, se repite aproximadamente 30 veces. Así, se logra que en cada ciclo se duplique el número de copias de cada una de las hebras del ADN molde, con lo que se logra un crecimiento exponencial.

Este procedimiento puede aplicarse directamente a una muestra clínica, para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo en particular, mediante la detección de una secuencia específica en su ácido nucleico. Para revelar el resultado del ensayo, la mezcla de reacción debe ser sometida a electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida. En esta, el ADN migra desde el polo negativo al positivo en diferentes grados según el peso molecular, es decir su tamaño en pares de bases. El fragmento a amplificar es por supuesto de tamaño conocido, por lo que podrá determinarse la presencia del gen buscado en la muestra, porque se habrá amplificado en la reacción y aparecerá una banda del tamaño correspondiente en el gel. Los geles deberán ser revelados para que desarrollen una reacción de color visible que nos ayude a determinar la presencia o ausencia de la banda de interés. En los geles de agarosa, el revelado se hace generalmente con bromuro de etidio, que es un agente intercalante del ADN, es decir que su molécula se intercala entre las bases del ácido nucleico. Este procedimiento colorea el gel porque el bromuro de etidio fluoresce bajo luz ultravioleta; por lo tanto cuando el gel se expone a la luz ultravioleta, se evidenciará o no la banda correspondiente.

 En los geles de poliacrilamida, el revelado puede realizarse con nitrato de plata. El resultado de la PCR también puede evidenciarse, combinado la PCR con una técnica de hibridación por sondas. Esto se logra transfiriendo el ADN del gel a una membrana (por ejemplo de nitrocelulosa) y ponerla en contacto con una sonda específica. En este caso el revelado lo brinda la marca de la sonda. Este procedimiento de transferencia de ADN a una membrana combinado con hibridación por sondas, se denomina Southern  Blott. Aunque hemos centrado el interés de estas técnicas de detección de ácidos nucleicos para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, también son usadas para diagnosticar algunas enfermedades neoplásicas y hereditarias. La aplicación de la biotecnología molecular a la medicina, representa un campo de in-tensa investigación y vertiginoso desarrollo. La prevención, el tratamiento y el diagnóstico de muchas enfermedades que hasta hace pocos años resultaba imposible, hoy son una realidad y cada vez la biología molecular aporta más conocimientos y tecnología aplicables a la mejora de la calidad de vida y la salud humana.

El diagnóstico genético es una herramienta o elemento básico dentro del área del asesoramiento genético y se utiliza para:

• Confirmar un diagnóstico clínico en pacientes para los que se sospecha de una enfermedad genética concreta, en función de los síntomas o rasgos físicos que presenta.
• Detectar portadores de mutaciones de enfermedades recesivas.
• Llevar a cabo diagnóstico prenatal.
• Llevar a cabo diagnóstico presintomático en personas con familiares afectados de enfermedades genéticas.
• Determinar si un paciente concreto podrá responder de forma adecuada a un fármaco en base a ciertas variantes genéticas.

Las enfermedades genéticas, aquellas causadas por alteraciones en el material hereditario, representan un porcentaje importante de las enfermedades humanas, tanto en adultos como en niños.

En los últimos años, los rápidos avances en el análisis y comprensión del genoma humano han permitido, por una parte, conocer las bases genéticas de muchas enfermedades hereditarias, que se transmiten a través de las generaciones, y por otra desarrollar pruebas para facilitar su diagnóstico. Así, en la actualidad existen pruebas específicas para más de miles de enfermedades monogénicas (causadas por un único gen) y se están llevando a cabo muchos avances en la estimación de riesgos o vulnerabilidad a las enfermedades multifactoriales. Igualmente, numerosos estudios muestran la posibilidad de llevar a cabo diferentes pruebas para estratificar a los pacientes según composición genética antes de definir la dosis o tratamiento terapéutico más efectivo.